Pyrogenicity

ЛАЛ-тест для определения пирогенности лекарственных препаратов является активно развивающимся в настоящее время способом контроля качества лекарственных средств. Он может быть использован и в некоторых других областях, где необходимо быстрое обнаружение грамотрицательных бактерий или их эндотоксинов. В основе этого теста лежит способность лизата амебоцитов (клеток крови) мечехвоста специфически реагировать с эндотоксинами грамотрицательных бактерий (липополисахаридами, ЛПС). В результате реакции эндотоксина и лизата происходит помутнение прозрачной реакционной смеси или образование твердого геля, что и служит индикатором присутствия эндотоксина.

Реакция лизата амебоцитов с эндотоксином была открыта в США в 1964 году, где и был налажен выпуск первых коммерческих препаратов. Поскольку первые исследования были проведены на мечехвостах вида Limulus polyphemus, препарат, полученный из их крови, был назван Лизат амебоцитов Limulus (Limulus amebocyte lysate), сокращенно ЛАЛ-реактив и, соответственно, ЛАЛ-тест.

ЛАЛ-тест считается сегодня наиболее надежным и перспективным способом проверки потенциальной пирогенности лекарственных средств. Преимущества этого теста: высокая чувствительность, простота выполнения, надежность, воспроизводимость, возможность получения количественного ответа. К несомненным преимуществам ЛАЛ-теста относится возможность анализировать в короткий срок большое число образцов. При массовом использовании ЛАЛ-тест, безусловно, дешевле теста на кроликах. Кроме того, этот метод дает возможность проводить постадийный контроль содержания эндотоксинов в процессе производства инъекционных препаратов.

Пирогены и эндотоксины

Термин «пироген» происходит от греческого “pyreto” – лихорадка. Пирогенами называют вещества, способные вызывать повышение температуры тела. Пирогенную реакцию способны вызывать вещества самой различной природы и разного происхождения. К пирогенам можно отнести грамотрицательные бактерии и их токсины, грамположительные бактерии и их токсины, вирусы и продукты их жизнедеятельности, а также стероиды и пр. В области контроля качества инъекционных лекарственных средств практическое значение имеют бактериальные эндотоксины, которые являются фрагментами внешней стенки грамотрицательных бактерий.

Грамотрицательные бактерии обладают двуслойной клеточной стенкой, которая окружает цитоплазматическую мембрану. Первый слой — очень тонкая (толщиной 1 нм) нелипидная мембрана, состоящая из пептидогликана. Его называют также гликопептидом или мукопептидом. Это сложный матрикс, содержащий полисахаридные цепи, связанные друг с другом поперечными сшивками из коротких пептидных цепей. Второй слой клеточной стенки — липидная мембрана толщиной 7,5 нм. Именно на этой внешней мембране и расположены эндотоксины (липополисахариды). Молекулы эндотоксина обеспечивают структурную целостность, отвечают за многие физиологические функции, в том числе определяют патогенные и антигенные свойства бактерий. Структурно молекула эндотоксина делится на три части – Липид А, Кор и О-специфическую цепь.

Липид А состоит из дисахарида, фосфата и жирных кислот. Жирные кислоты, входящие в состав Липида А, могут быть насыщенными и ненасыщенными. Наиболее часто в состав Липида А входят кислоты: пальмитиновая, лауриновая, глутаминовая, меристиновая. Участок Липида А является наиболее константным участком молекулы ЛПС, и его строение схоже у многих бактерий.

О-специфическая цепь липополисахаридов построена из повторяющихся олигосахаридов. Наиболее распространенными сахарами, входящими в состав О-специфической цепи, являются глюкоза, галактоза, рамноза. Этот участок молекулы придает ей гидрофильные свойства, благодаря которым ЛПС хорошо растворимы в воде. Полисахаридная часть является наиболее вариабельной частью молекулы ЛПC. Часто этот фрагмент молекулы называют О-антигеном, так как именно он отвечает за антигенную активность грамотрицательных бактерий.

Кор — центральная часть молекулы, связывающая О-антиген с Липидом А. Формально структура кора подразделяется на внешнюю и внутреннюю части. В состав внутренней части кора обычно входят остатки L-глицеро-О-манногептозы и 2-кето-3-дезоксиоктоновой кислоты (КДО). КДО содержит 8 атомов углерода и в природе практически нигде больше не встречается.

Кроме липополисахаридов в состав внешней стенки грамотрицательных бактерий входят и белки (внешняя мембрана на ¾ состоит из ЛПС, и только ¼ приходится на белковые компоненты). Эти белки вместе с ЛПС образуют белково-липополисахаридные комплексы разного размера и молекулярной массы. Именно эти комплексы и называютсябактериальными эндотоксинами. Очищенные препараты, которые используются в качестве стандартов, лишены пептидных фрагментов и представляют собой чистый препарат липополисахарида. Тем не менее, термин «бактериальные эндотоксины» применяется с равным успехом и к естественным эндотоксинам, оказавшимся в растворе в результате разрушения бактерий, и к чистым препаратам ЛПС.

На внешней стенке одной грамотрицательной бактерии может содержаться до 3,5 млн. молекул ЛПС. После ее гибели все они оказываются в растворе. Эндотоксины грамотрицательных бактерий остаются биологически активными молекулами и после гибели бактерий. Молекула эндотоксина температуростабильна и легко выдерживает цикл стерилизации в автоклаве. Малые размеры молекул эндотоксинов позволяют им легко проходить через мембраны, используемые для стерилизации растворов (0,22 мкм). Поэтому эндотоксины могут присутствовать в готовых лекарственных формах, даже произведенных в асептических условиях и прошедших финишную стерилизацию.

Бактериальные эндотоксины являются исключительно активными (сильными) пирогенами. Для развития лихорадочного приступа достаточно присутствия бактериальных эндотоксинов в инфузионном растворе в концентрации 1 нг/мл (около 10 ЕЭ/мл). Другие пирогены менее активны, и для развития пирогенного ответа их концентрация должна быть в 100-1000 раз больше. Обычно термины «пирогены» и «эндотоксины» употребляются как синонимы и, хотя не все пирогены являются эндотоксинами, наиболее значимыми являются именно эндотоксины грамотрицательных бактерий.

Природа реакции

По современным представлениям в лизате амебоцитов находятся, как минимум, три фермента и белок-субстрат. Ферменты находятся в форме предшественников, первый из них, Фактор С, способен специфически связываться с эндотоксинами. Он переходит в активную форму: активный Фактор С. Активный Фактор С переводит в активную форму следующий фермент: Фактор В. Последний в ряду ферментов, профермент, и его активная форма: свертывающий фермент. Свертывающий фермент перерабатывает субстрат: коагулоген. Молекула коагулогена разрезается на несколько полипептидных цепей, между которыми затем образуются связи, в результате чего получается пространственная структура геля.

Ферменты, составляющие систему свертывания мечехвостов, являются сериновыми протеазами, очень похожими на факторы свертывания крови у млекопитающих. То же самое можно сказать и о субстрате, не случайно название коагулоген сходно с названием белка субстрата в системе коагуляции млекопитающих: фибриногеном.

Для активации ферментной системы, точнее первого фермента в каскаде, Фактора С, нужны минимальные концентрации бактериальных эндотоксинов.

В основе всех методов оценки концентрации эндотоксинов лежит измерение степени активации ферментной системы, хотя способы измерения её активности могут быть различными. Концентрация эндотоксина может быть определена путем оценки количества переработанного субстрата (естественного или искусственного) за определенный промежуток времени: анализы по конечной точке. Она также может быть определена путем оценки времени, необходимого для переработки определенного количества субстрата (точнее по определению скорости этой переработки): кинетические анализы.

В естественной ситуации свертывающий фермент разрезает коагулоген на несколько фрагментов, которые затем полимеризуются. В результате реакции с прозрачной реакционной смесью происходят изменения, которые выражаются в помутнении содержимого, образовании вязких гелевых масс и, в конце концов, в образовании твердого геля. Гель, образующийся в результате реакции, удерживается в виде плотного опалесцентного сгустка на дне пробирки при ее переворачивании на 180°. Такой наиболее простой способ оценки активности ферментной системы называется гель-тромб тест.

Процессу образования геля предшествует процесс полимеризации субъединиц коагулина, который сопровождается помутнением реакционной смеси. Степень этого помутнения может быть измерена фотометрически. Чем выше концентрация эндотоксина, тем активнее ферментная система, тем меньше надо времени для переработки субстрата, тем быстрее идет реакция. Метод, в котором результат реакции определяется по степени этого помутнения, называется турбидиметрическим тестом.

Пожалуй, наиболее интересным способом измерения активности ферментной системы является хромогенный тест. Для проведения этого анализа используется специальный ЛАЛ-реактив, в котором коагулоген заменен на искусственный хромогенный субстрат. Хромогенный субстрат представляет собой простой полипептид с хромофором на конце. Последовательность аминокислотных остатков в полипептиде аналогична аминокислотной последовательности коагулогена, предшествующей связи, разрезаемой свертывающим ферментом. Активный свертывающий фермент отрезает хромофор от пептидной цепи, и в растворе развивается желтое окрашивание. Интенсивность окраски пропорциональна активности свертывающего фермента, которая в свою очередь определяется количеством эндотоксина в растворе. Интенсивность окраски также измеряется фотометрически.

Кинетические методы позволяют проводить точное количественное определение концентрации эндотоксина в растворе. Они позволяют во многом стандартизировать и автоматизировать процесс проведения реакции. Важным считается и тот факт, что автоматическая обработка и хранение результатов снижают риск получения ошибки, связанной с человеческим фактором.

Источник

Методы обнаружения бактериальных эндотоксинов в фармацевтических препаратах и имплантируемых медицинских изделиях

Бактериальные эндотоксиныявляются ключевым вопросом безопасности и качества в фармацевтической и медицинской промышленности. Важность бактериальных эндотоксинов заключается в том, что они относятся к пирогенам. К пирогенам относятся разнообразные группы соединений, определяемые их способностью вызывать быстрое повышение температуры тела при их введении в кровоток («Pyro» происходит от греческого слова, обозначающего огонь).

Наличие пирогенов может привести к быстрой воспалительной реакции и сильному шоку, за которым в некоторых случаях следует отказ органов и в конечном итоге смерть. Очевидно, что присутствие пирогенов в любом инъекционном фармацевтическом препарате или на поверхностях медицинских изделий, которые будут контактировать с циркулирующей кровью или спинномозговой жидкостью, является потенциальной опасностью, и важно иметь возможность протестировать широкий спектр продукции на наличие этих соединений. Бактериальные эндотоксины, безусловно, являются наиболее распространенным пирогеном и наиболее вероятно будет обнаружен в производственной среде, поэтому тестирование фокусируется на методах его обнаружения.

Термин бактериальные эндотоксины является практически синонимом липополисахариду (ЛПС/LPS), который является основным компонентом наружного слоя клеточной стенки у грамотрицательных бактерий. Грамотрицательная клеточная стенка более сложна, чем у грамположительных бактерий, и имеет внешнюю мембрану или оболочку, состоящую из ЛПС. Она действует как барьер проницаемости для клетки и также важнадляформирования биопленок и улавливания макромолекул из окружающей среды.

При грамотрицательном бактериальном сепсисе высвобождение пирогенных ЛПС вызывает выделение большого количества воспалительных цитокинов, что может привести к токсическому шоку. Грамотрицательные бактерии постоянно синтезируют ЛПС, чтобы заменить потери с поверхности клетки, и когда клетки умирают, они высвобождают ЛПС из клеточной стенки. Это означает, что свободные ЛПС всегда будут присутствовать в среде, содержащей грамотрицательные виды. Грамположительные бактерии, напротив, не выделяют внеклеточные ЛПС.

Поэтому важно контролировать рост грамотрицательных видов в воде, в других сырьевых материалах и в производственной среде, чтобы предотвратить производство пирогенов. Однако отсутствие грамотрицательных бактерий не означает отсутствия пирогенов. ЛПС является очень стабильным веществом и не разрушается нагреванием или другими средствами. Он может сохраняться очень долго в жидкостях и на сухих поверхностях при отсутствии жизнеспособных бактерий. Это значит, что тесты, специально разработанные для выявления эндотоксина/ЛПС, необходимы для демонстрации безопасности фармацевтических и медицинских изделий.

Метод обнаружения

Первым методом, широко используемым для обнаружения эндотоксина в фармацевтических препаратах, был пирогенныйтест на кролике, первоначально описанный в 1925 году. Этот метод включает в себя инъекции кроликам тестируемой жидкости, а затем наблюдение за ними на предмет любого повышения температуры тела и симптомов лихорадки. Данный метод используется при определении пирогенности, согласно ГОСТ ISO 10993-11-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 11. Исследования общетоксического действия» и ОФС.1.2.4.0005.15 «Пирогенность». Пирогенный тест на кролике является одновременно трудоемким и дорогостоящим для выполнения и не может быть количественным. Его применение также ограничено продуктами, которые не вызывают побочных эффектов у подопытных животных. Этот тест по-прежнему одобрен в качестве метода обнаружения пирогенов, но в настоящее время используется редко, поскольку он был в значительной степени заменен лизатом амебоцитов мечехвоста (Limulus Amebocyte Lysate) или LAL-тестом.

LAL-Тест

LAL-тест берет свое начало в открытии 50-х годов прошлого века, демонстрирующим, что кровь Атлантического мечехвоста (Limulus polyphemus) образует сгустки в присутствии бактериального эндотоксина. Позже было установлено, что эта реакция вызвана фактором свертывания, содержащимся в гранулах подвижных клеток крови, называемых амебоцитами. Фактор свертывания высвобождается в кровь из клеткив качестве защиты от инфекции, когда обнаруживается эндотоксин. Наличие даже очень низких уровней бактериального эндотоксина запускает «коагуляционный каскад» реакций, включающий ряд ферментов сериновой протеазы и приводящий к образованию тромба (сгустка)коагулинового геля. Эта реакция была превращена в чувствительный тест на эндотоксин путем сбора амебоцитов из крови мечехвостов и последующего лизирования клеток с получением реагента, содержащего фактор свертывания – лизатамебоцитов мечехвоста.

Были разработаны три основных LAL-метода: гель-тромб, хромогенный и турбидиметрический. Метод гель-тромб может быть положен в основу очень простого метода детектирования путем добавления реагента к образцу в пробирке и инкубации при 37°C в течение одного часа. Если тромб (сгусток) виден при инверсии трубки, то результат положительный. Это метод конечной точки, и его можно сделать полуколичественным путем тестирования последовательных разведений. Результаты выражаются в единицах эндотоксина (EU), что является мерой эффективности эндотоксина, а не его количества. Это отражает вариабельность токсичности природных ЛПС. Хромогенный метод использует синтетический субстрат, который меняет цвет, когда он расщепляется эндотоксин-активированной протеазой, в то время как турбидиметрический метод опирается на развивающийся сгусток коагулинового геля, изменяющий мутность образца. Оба метода могут быть использованы в качестве количественных кинетических методов путем построения стандартных кривых времени начала воздействия на концентрацию эндотоксина. Спектрофотометрические приборы могут обнаруживать изменения мутности или цвета при гораздо более низких концентрациях эндотоксина, чем те, которые необходимы для образования видимого тромба (сгустка) геля, что делает хромогенные и турбидиметрические методы гораздо более чувствительными, чем метод геля-тромб. Чувствительность определяется самой низкой концентрацией на стандартной кривой.

LAL-тест в настоящее время является стандартным методом тестирования бактериальных эндотоксинов парентеральных лекарственных препаратов и медицинских изделий и определяется как гармонизированный метод в фармакопеях США, Европы, Японии и России (USP chapter 85, EP 2.6.14 Supplement 6.6, JP General Test 4.01, ОФС.1.2.4.0006.15 «Бактериальные эндотоксины»). Можно использовать любой из трех методов, но эталонным методом в случае возникновения каких-либо споров является предельный тест геля-тромб. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) также опубликовало детальное руководство по тестированию бактериальных эндотоксинов и пирогенов для фармацевтической и медицинской промышленности в 2012 году.

Оно включает в себя информацию о планах отбора проб, хранении образцов, валидации альтернативных тестов на бактериальные эндотоксины и предпочтительном использовании количественных тестов в программах качества по дизайну (QBD). При проведении тестирования на бактериальные эндотоксины необходимо учитывать ряд важных моментов. Один из них заключается в том, чтобы обеспечить использование во время тестирования лабораторного оборудования и реагентов без пирогенов для избегания ложноположительных результатов. Медицинские изделия обычно проверяются путем промывки поверхности стандартным объемом специально подготовленной апирогенной воды или подходящим растворителем. Ряд факторов может помешать проведению теста, воздействуя либо на бактериальный эндотоксин, либо на LAL-реагент. Примеры включают рН, концентрацию белка и наличие примесей химических веществ в парентеральных препаратах или в их смывах. Интерференция может привести к неспособности обнаружить бактериальные эндотоксины, и поэтому очень важно его идентифицировать. Лучше всего это сделать с помощью образцов положительного контроля, в которые добавлен подходящий эталонный стандарт бактериального эндотоксина или сертифицированный стандарт.

Существует широкий спектр коммерческих тестовых продуктов, основанных на LAL-методологии, которые ориентированы на удобство и простоту использования. Реактивы для гель-тромб, хромогенных и турбидиметрических испытаний – все они доступны, оптимизированы для конкретного метода и поставляются в лиофилизированной форме с подложками и буферами, готовыми к восстановлению перед использованием. Реагенты выпускаются в количествах, пригодных для одиночных испытаний, для многократных испытаний или навалом для лабораторий, работающих с большим количеством образцов.

Простые тесты на тромб геля могут быть проведены с минимальным оборудованием, в то время как кинетические тесты, по крайней мере, требуют спектрофотометра. Многие коммерческие реагенты теперь предназначены для использования в формате микропланшетов. Степень автоматизации может быть достигнута с помощью считывателей инкубационных пластин, оснащенных программным обеспечением, предназначенным для проведения анализа бактериальных эндотоксинов, таким как Endoscan-V ™ от Charles River.

Экспресс LAL-методы

Сокращение времени, затрачиваемого на выполнение тестов, является меньшей проблемой для определения бактериальных эндотоксинов, чем для других микробиологических анализов, поскольку стандартный метод занимает немногим более часа. Тем не менее, быстрые тесты были разработаны и доступны на коммерческой основе. Одним из примеров является система Charles River Endosafe®-PTS ™, основанная на кинетической хромогенной методике с точным количеством LAL-реагента, хромогенного субстрата и контрольного бактериального эндотоксина, предварительно загруженного в четырехканальный картридж. Картридж помещается в ручной считыватель, а затем образец добавляется в четыре лунки на одном конце, прежде чем быть вытянутым через каналы, содержащие реагенты. Результаты доступны примерно через 15 минут, и система предназначена для тестирования на месте использования. Система Endosafe® -MCS с несколькими картриджами, использующая ту же технологию, также доступна для тестирования нескольких образцов в лабораторных условиях, в то время как Endosafe® Nexus ™ — это полностью автоматизированная роботизированная система, подходящая для тестирования большого объема воды. Другой подход был принят компанией Highland Biosciences, которая разработала систему Pyro Xpress™. При этом также используются картриджи, которые могут быть предварительно загружены реагентами или принимать реагенты, поставляемые пользователем. Она основана на простой, недорогой методике гель-тромб и использует технологию «многолучевого резонатора» в блоке считывания, который может выдавать результаты всего за пять минут, а также способен предоставлять кинетические данные.

Альтернативы LAL-тесту

Хотя LAL-тест остается стандартным методом для тестирования бактериальных эндотоксинов, существуют опасения по поводу некоторых аспектов этого метода, которые привели к разработке альтернатив. Например, коммерческие партии лизата могут отличаться по своей чувствительности к бактериальным эндотоксинам, а также по своей специфичности. Но потенциально более серьезной проблемой является сокращение запасов мечехвостов. В то время как кровь этих существ может быть собрана без ущерба для животного, другие экологические нагрузки приводят к тому, что дикая популяция становится под угрозой исчезновения. Отсутствие необходимости собирать их кровь для производства LAL, безусловно, поможет в их сохранении. Многое уже было достигнуто за счет сокращения количества LAL-реагента, необходимого для проведения анализов, но методология все еще опирается на достаточный запас мечехвостов и в конечном счете может оказаться неустойчивой.

Одним из решений этой проблемы является разработка методов тестирования с использованием рекомбинантного фактора С (recombinant Factor C/rFC), эндотоксин-чувствительного белка, который действует как праймер для каскадной реакции свертывания крови в LAL-тестах. Сложная генная инженерия позволила создать высокочувствительный rFC, который может быть использован в качестве основы альтернативного метода тестирования бактериальных эндотоксинов, не зависящего от мечехвостов. Это было превращено в коммерческие тестовые продукты, в частности в систему Pyrogen™ , поставляемую компанией Lonza. Пироген – это анализ конечной точки на основе rFC, который активируется бактериальными эндотоксинами и затем расщепляет синтетический субстрат для высвобождения флуорогенного соединения. Он работает в формате микропланшета и занимает один час, чтобы получить количественный результат. Это говорит, что он более специфичен, чем традиционные LAL-анализы, и не подвержен ложным срабатываниям, вызванным глюканом, что может быть проблемой в LAL-тестах. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрило тестирование бактериальных эндотоксинов на основе rFC для выпуска конечного продукта, при условии, что он должным образом проверен на соответствие эталонному тесту предела гель — тромба.

Еще одним альтернативным методом является тест на активацию моноцитов (monocyte-activation testing/MAT), который использует иммунную реакцию, обнаруженную в крови человека. Тест использует моноциты, которые активируются пирогенами, чтобы произвести воспалительный цитокин интерлейкин-1β (IL-1β), который затем может быть обнаружен с помощью анализа ELISA. Этот метод не является специфичным для бактериальных эндотоксинов, но также обнаруживает другие пирогены и одобрен EP в качестве альтернативы in vitro теста на пироген кролика. Это говорит, что он является лучшим индикатором реакции лихорадки человека на пирогены, чем LAL-тест, потому что он основан на иммунном ответе человека. MAT-тест был реализован в коммерческих продуктах, таких как система Pyro Detect, поставляемая компанией Merck Millipore.

Источник

LAL-тест (определение эндотоксинов — хромогенный тест), 3 х 96 (405 нм)

Метод Hbt LAL это чувствительный и специфичный набор для определения и измерения бактериального эндотоксина, вызывающего лихорадку продукта грам-отрицательных бактерий, известного как пироген. Тест основан на том факте, что эндотоксин вызывает мутность и загущение LAL (Лизат амебоцитов Limulus), этот процесс основан на энзиматической реакции. Простота и экономичность LAL теста способствует его применению для анализа различных биологических жидкостей (включая сыворотки), устройств, (воздушных)фильтров и культуральных сред.

Назначение

Метод Hbt LAL предназначен для количественного измерения эндотоксина в культуральной среде, плазме, сыворотке и других растворах. Предел чувствительность метода составляет 1.4 пг/мл и диапазон измеряемых концентраций от 1 до 1,000 пг/мл.

Принцип метода

Frederick Bang наблюдал, что бактерии вызывают внутрисосудистую коагуляцию у американского мечехвоста, Limulus polyphemus. В сотрудничестве Levin и Bang обнаружили, что агент, ответственный за свертывание постоянно присутствует в амебоцитах мечехвоста, или циркулирующих клетках крови, и что пироген (бактериальный эндотоксин) энзиматически вызывает помутнение и гелеобразование.

Настоящий метод использует активацию энзима. В присутствии бесцветного субстрата, Энзиматическая реакция будет вызывать развитие желтого окрашивания по мере расщепления хромофора, p-нитроанилина (pNA). Реакция останавливается добавлением уксусной кислоты и абсорбция при длине волны 405 нм измеряется с помощью спектрофотометра. Концентрация эндотоксина в образце с неизвестной концентрацией, который тестируется одновременно со стандартами, может быть определена из калибровочной кривой.

Источник

Определение пирогенов
и бактериальных эндотоксинов

Альгимед предлагает решения для определения бактериальных эндотоксинов и пирогенов самыми современными методами. Для проведения ЛАЛ-теста методом гель-тромб тест мы предлагаем ЛАЛ-реактив PYROSTAR ES-F производства Wako Chemicals USA, Inc. Данный реактив является эндотоксин-специфичным ЛАЛ-реактивом нового поколения. Он содержит карбоксиметилкурдлан, который лиофилизирован вместе с лизатом. Это делает ЛАЛ-реактив невосприимчивым к присутствию в препарате β-1,3-глюканов.

Для проведения инструментальных методов анализа мы предлагаем ЛАЛ-реактивы и программное обеспечение производства Лонза, США. Компания Лонза является лидером в развитии инструментальных методов определения бактериальных эндотоксинов. При заказе измерительного комплекса для количественного определения бактериальных эндотоксинов, состоящего из спектрофотометра и программного обеспечения WinKQCL, сертифицированные специалисты из европейского подразделения Лонзы осуществляют поддержку наших клиентов в установке и проведении IQ/OQ/PQ валидации оборудования.

С января 2021 года вступает в силу новая статья Европейской Фармакопеи 2.6.32 «Тест на бактериальные эндотоксины с использованием рекомбинантного фактора С». Данный метод уже вызвал к себе интерес и среди российских лабораторий. Мы предлагаем полное оснащение лаборатории для проведения данного анализа и обучение работе с методом.

Новый метод определения пирогенных веществ in-vitro – тест активации моноцитов (МАТ). Данный высокочувствительный метод позволяет полностью отказаться от использования животных и основан на естественном иммунном ответе человека на пирогенные вещества. Тест включен в Государственную Фармакопею. Мы предлагаем готовые наборы для проведения МАТ производства компании MAT Research, Голландия, и обучение постановке данного теста.

ЛАЛ-реактив

Рекомбинантный фактор С

Тест активации моноцитов

Контрольные стандарты и индикаторы эндотоксина

Вспомогательные реактивы

ЛАЛ-реактив

Биохимический реактив, получаемый из лизированных амебоцитов (клеток крови) мечехвостов вида Limulus Polyphemus. Обладает высокой чувствительностью к бактериальным эндотоксинам и используется для определения их содержания в лекарственных препаратах и активных фармацевтических субстанциях.

Чувствительность ЛАЛ-реактива (λ)

Обозначается греческой буквой λ. Выражена в единицах эндотоксина на миллилитр, ЕЭ/мл и соответствует минимальной концентрации Международного стандарта эндотоксина, которая вызывает образование плотного геля при реакции с данным реактивом (в гель-тромб тесте), или соответствует точке с минимальным значением на стандартной кривой (в фотометрических методах анализа).

Контрольный стандарт эндотоксина (КСЭ)

Очищенный липополисахарид, полученный из штамма E. Coli. Активность контрольного стандарта эндотоксина установлена по международному стандарту эндотоксина. Используется для подтверждения заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива и для постановки контролей. Активность контрольного стандарта выражается в Единицах эндотоксина (ЕЭ).

Бактериальные эндотоксины

Фрагменты клеточных стенок грамотрицательных бактерий. Представляют собой сложные липополисахаридные комплексы. При попадании в организм человека через парентеральный путь введения вызывают пирогенный ответ (повышение температуры тела). Так как грамотрицательные бактерии вездесущи по своей природе, бактериальные эндотоксины могут попадать в лекарственные препараты в процессе их производства из фармацевтических субстанций, лабораторной посуды, воды, производственного оборудования.

Вода для ЛАЛ-теста

Для приготовления растворов ЛАЛ-реактива, контрольного стандарта эндотоксина и разведений испытуемого лекарственного препарата используют воду для ЛАЛ-теста. Вода для ЛАЛ-теста должна соответствовать требованиям, предъявляемым к воде для инъекций, и при этом не должна содержать бактериальные эндотоксины в количествах, определяемых в тесте.

Гель-тромб тест

Метод проведения ЛАЛ-теста, в котором результаты анализа определяются визуально. Анализ проводят в стеклянных пробирках размером 10х75 мм, в которых смешиваются равные части ЛАЛ-реактива и испытуемого препарата. Пробирки с реакционной смесью инкубируют в водяной бане или термоблоке при температуре 37°С ± 1 °С в течение одного часа. По истечении времени инкубирования результаты определяются визуально: если в пробирках образовался плотный гель, который не стекает при однократном переворачивании пробирки на 180О, то результат засчитывается как положительный. Если в пробирке остался раствор или образовался гель, который стекает при переворачивании пробирки, то результат реакции считается отрицательным. Гель-тромб тест – это самый простой метод проведения ЛАЛ-теста, который не требует приобретения дорогостоящего оборудования. Освоение ЛАЛ-теста проще всего начинать именно с этого метода.

Качественный гель-тромб тест (метод А)

Задачей этого анализа является подтверждение того, что содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом образце не превышает значения предельного содержания бактериальных эндотоксинов, указанного в фармакопейной статье. В качественном гель-тромб тесте испытуемый препарат проверяется в двух повторностях в одном выбранном разведении. Если в этом разведении получены положительные результаты, то содержание эндотоксинов в данном препарате более или равно фактору этого разведения, умноженному на чувствительность используемого ЛАЛ-реактива.

Количественный гель-тромб тест (метод В)

Этим методом определяют содержание бактериальных эндотоксинов с помощью ряда последовательных разведений испытуемого лекарственного средства. В анализ ставится серия последовательных двукратных разведений препарата, не менее четырех разведений. Положительный контроль испытуемого препарата (контроль ингибирования) ставится для наименьшего разведения испытуемого препарата, так как ингибирование прямо зависит от концентрации испытуемого препарата в растворе. В анализе определяется конечная точка реакции для каждой повторности. Конечная точка реакции – это наименьшее разведение для каждой повторности, в которой еще происходит образование геля. Концентрация бактериальных эндотоксинов в испытуемом препарате для каждой повторности рассчитывается как произведение фактора разведения для конечной точки реакции на чувствительность ЛАЛ-реактива. Далее рассчитывается среднее геометрическое значение для всех повторностей, как в опыте «Подтверждение заявленной чувствительности ЛАЛ-реактива».

Если для всех разведений испытуемого препарата получены отрицательные результаты, то содержание бактериальных эндотоксинов будет менее значения фактора разведения наименьшего разведения, умноженного на чувствительность ЛАЛ-реактива.

Если для всех разведений испытуемого препарата получены положительные результаты, то содержание бактериальных эндотоксинов будет более или равно значению фактора разведения наибольшего разведения, умноженного на чувствительность ЛАЛ-реактива.

Предельное содержание бактериальных эндотоксинов

Допустимое содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, указанное в фармакопейной статье. Для расчета предельного содержания бактериальных эндотоксинов используют следующую формулу:
Предельное содержание бактериальных эндотоксинов = К / М, где:

К — пороговая пирогенная доза, равная 5 ЕЭ/кг в 1 час для испытуемого лекарственного препарата (если он вводится пациенту любым парентеральным путем, кроме интратекального). При интратекальном пути введения лекарственного препарата К составляет 0,2 ЕЭ/кг;

М — максимальная терапевтическая доза испытуемого лекарственного средства, вводимая в течение одного часа (выражается в мг, мл или ЕД на 1 кг массы тела).

Для радиофармацевтических лекарственных препаратов, вводимых внутривенно, предельное содержание бактериальных эндотоксинов рассчитывают как 175/V, где V – максимальная рекомендованная доза в мл. Для радиофармацевтических лекарственных препаратов, вводимых интратекально, предельное содержание бактериальных эндотоксинов равняется 14/V.
Для лекарственных препаратов, доза которых рассчитывается на м2 поверхности тела (например, противоопухолевые препараты), пороговая пирогенная доза (К) составляет 100 ЕЭ/м2 .

Максимально допустимое разведение препарата (МДР)

Максимально допустимое разведение (МДР) представляет собой наибольшее разведение испытуемого лекарственного средства, в котором возможно определение концентрации эндотоксина, соответствующей значению предельного содержания бактериальных эндотоксинов, установленному для данного лекарственного средства. МДР – это такое разведение испытуемого препарата, в котором можно сделать однозначный вывод о соответствии/несоответствии лекарственного препарата требованию раздела «Бактериальные эндотоксины».
Испытуемое лекарственное средство может быть проверено в одном разведении или в серии разведений при условии, что конечная степень разведения не превысит значения МДР, которое рассчитывается по формуле:

где:
«предельное содержание бактериальных эндотоксинов» — допустимое содержание бактериальных эндотоксинов в испытуемом лекарственном средстве, указанное в фармакопейной статье;

«концентрация испытуемого раствора» — концентрация лекарственного средства или действующего вещества, для которого указано предельное содержание бактериальных эндотоксинов

λ — чувствительность ЛАЛ-реактива, в ЕЭ/мл.

Положительный контроль испытуемого препарата

Представляет собой испытуемый препарат в выбранном разведении, к которому добавлен эндотоксин в концентрации, в два раза превышающей чувствительность используемого ЛАЛ-реактива (то есть, 2 λ). Данный контроль должен быть положительным и позволяет удостовериться в том, что испытуемый препарат в выбранном разведении не ингибирует реакцию гелеобразования.

Положительный контроль опыта

Представляет собой воду для ЛАЛ-теста, к которой добавлен эндотоксин в концентрации, в два раза превышающей чувствительность используемого ЛАЛ-реактива (то есть, 2 λ). Данный контроль должен быть положительным и позволяет удостовериться в том, что ЛАЛ-реактив и контрольный стандарт эндотоксина не потеряли своих свойств в процессе транспортировки и хранения.

Отрицательный контроль опыта

Представляет собой воду для ЛАЛ-теста. Данный контроль должен быть отрицательным и позволяет удостовериться в том, что все используемые в опыте материалы не содержат бактериальные эндотоксины в определяемых в тесте количествах.

Ничего не найдено 🙁 Попробуйте ввести, к примеру, лал-реактив

Определение содержания бактериальных эндотоксинов

ООО «Альгимед» на базе собственной оснащенной лаборатории в РФ предлагает проведение определения бактериальных эндотоксинов в образцах заказчика различными фармакопейными методами:

• методом гель-тромб тест (методы А и В)
• хромогенным кинетическим методом (метод D)

Определение бактериальных эндотоксинов проводится как для препаратов, имеющих утвержденную НД с уровнем предельного содержания бактериальных эндотоксинов, так и для неизвестных образцов, не имеющих утвержденной нормативной документации по показателю «Бактериальные эндотоксины».
Также лаборатория предлагает проведение предварительных анализов и отработку методики постановки анализа «Мешающие факторы» для тех испытуемых образцов, для которых уже есть утвержденный заказчиком уровень предельного содержания бактериальных эндотоксинов и требуется провести отработку валидации метода для конкретного препарата.

Подробнее

• Проведение качественного или количественного анализа одного образца, для которого имеется утвержденный уровень предельного содержания БЭ — 3 600,00 RUB, включая НДС 20%.
• Проведение исследовательского анализа одного образца, не имеющего утвержденного уровня предельного содержания БЭ — 4 320,00 RUB, включая НДС 20%.
• Проведение цикла предварительных анализов и отработка методики постановки анализа «Мешающие факторы» для препарата, имеющего утвержденный уровень предельного содержания БЭ – 36 000,00 RUB, включая НДС 20%.
• Разработка стандартной операционной процедуры (СОП) рутинной проверки лекарственного препарата по показателю «Бактериальные эндотоксины», для которого уже есть установленный уровень предельного содержания БЭ — 14 400,00 RUB, включая НДС 20%.

Образцы принимаются по адресу:

г. Москва, ул. Барклая, д. 6, стр. 5, БЦ «Барклай Плаза», офис 622.
Контактное лицо: Тутнова Анна
Телефон: +7(499)682-61-09
Время приема образцов: 9.00 – 17.30.

Расходные материалы

Расходные материалы, используемые в ЛАЛ-тесте, должны быть апирогенными, то есть не содержать бактериальные эндотоксины в определяемых в тесте количествах. Для проведения инструментальных методов анализа используются стерильные апирогенные планшеты. Для отбора, транспортировки и хранения образцов могут быть использованы стерильные апирогенные контейнеры.

Пробирки для ЛАЛ-теста

Для проведения ЛАЛ-теста используются апирогенные стеклянные пробирки. Пробирки 10х75 мм используются для проведения в них гель-тромб теста. Пробирки 10х75 мм с навинчивающимися крышками могут использоваться как для проведения реакции, так и для хранения замороженного ЛАЛ-реактива, разделенного на аликвоты. Для подготовки разведений испытуемого препарата и контрольного стандарта эндотоксина используются пробирки 13х100 мм и 12х75 мм. Все пробирки используются в ЛАЛ-тесте однократно.

Источник